不同方法提取SD大鼠膝关节软骨组织的总RNA

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.51.001

摘要/Abstract

摘要：

背景：目前文献报道的软骨RNA提取有多钟方法，国内文献报道多为经典Trizol法，在实验中发现该方法提取的RNA并不能满足后续实验的需要。

目的：探索不同方法提取SD大鼠软骨组织总RNA的区别。

方法：选取3月龄SD大鼠9只，分别采用Rneasy Lipid Tissue Kit、RNAout试剂盒和经典Trizol法对软骨组织进行总RNA提取，并通过RNA琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性，以探寻软骨总RNA最佳提取方案。

结果与结论：Trizol法提取的RNA A₂₆₀/A₂₈₀值为1.58，说明纯度不高；RNAout法提取的RNA，由于软骨含有大量的蛋白多糖和胶原，也不能满足后续实验的需要；RNeasy^® Mini Kit法和肝(Trizol)法提取RNA的A₂₆₀/A₂₈₀值分别为2.00和1.98，说明提取的总RNA或核酸的纯度高。RNA的完整性电泳结果显示，RNeasy^® Mini Kit法、RNAout法和肝(Trizol)法可见28 s、18 s及5 s条带，而Trizol法未见任何条带，RNAout法28 s和18 s条带不清楚。结果提示Rneasy Lipid Tissue Kit法获得的总RNA纯度高、完整性和稳定性好，并能成功反转录合成双链cDNA，而RNAout试剂盒和经典Trizol法获得的总RNA不能满足后续实验需要。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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关键词: 组织构建, 软骨组织构建, 软骨, RNA提取, 大鼠, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Currently, there are many methods to extract cartilage RNA reported in the literature, and classic Trizol method has been mostly reported in China. However, it is discovered that RNA extracted by the Trizol method cannot meet the needs of the follow-up experiments.
OBJECTIVE: To explore the difference of different methods to extract total RNA from the cartilage tissues of Sprague-Dawley rats.
METHODS: Nine Sprague-Dawley rats of 3 months old were selected to extract total RNA respectively by Rneasy Lipid Tissue Kit, RNAout kit and classic Trizol method. Agarose gel electrophoresis was used to detect RNA integrity in order to explore the best extraction scheme of total RNA.
RESULTS AND CONCLUSION: When Trizol method was used to extract RNA, the A₂₆₀/A₂₈₀ value was 1.58, indicating that the purity was not high. Due to a large number of proteoglycan and collagen in the cartilage, RNA extracted using RNAout method cannot meet the needs of the follow-up study. When RNeasy® Mini Kit and liver method (Trizol) were used to extract RNA, the A₂₆₀/A₂₈₀ values were 2.00 and 1.98, respectively, indicating that the extracted total RNA or nucleic acid had high purity. The RNA electrophoresis results showed that using RNeasy ®Mini Kit, RNAout and liver method (Trizol), 18 s, 28 s and 5 s stripes were visible; but there was no stripe using Trizol method. For RNAout method, 28 s and 18 s stripes were unclear. These results show that the total RNA obtained by the Rneasy Lipid Tissue Kit has the high purity, integrity and stability, and can successfully synthesize double-stranded cDNA by reverse transcriptase, but RNAout kit and classic Trizol methods cannot meet the need of subsequent experiments.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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Key words: cartilage, RNA, rats

中图分类号:

R318

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图/表（结果） 3

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引言

材料方法

设计：单一样本观察。

时间及地点：实验于2012年10月至2013年1月在广州中医药大学国家重点中医骨伤科学实验室完成。

材料：

实验动物：选取3月龄SD大鼠共9只，雌性，体质量(200±20) g，由广州中医药大学实验动物中心提供，合格证号：SCXK(粤) 2006-0015。实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。

实验方法：

制作膝骨性关节炎模型：采用经典Hulth方法制作膝骨性关节炎模型^[6]。

将SD大鼠左侧膝关节内侧副韧带切断，切除前后交叉韧带和内侧半月板。术后常规肌肉注射青霉素，20×10⁴ U/只，连续3 d。造模后4周，断颈处死大鼠，取关节软骨组织，-80 ℃保存。

软骨总RNA提取：

第1种方法：将软骨组织放于研钵中，在液氮下研磨成粉状，加入Trizol研磨(50 mg的组织加1 mL的Trizol液)，将研磨液倒入1.5 mL EP管中，振荡混匀，置于冰上10 min，加入氯仿(Trizol液的1/5体积量)，盖紧离心管盖，振荡混匀，室温静置5 min，12 000 r/min，4 ℃离心15 min，用移液枪吸取上清液转移至另一新的离心管中，加入等体积的异丙醇，充分混匀后在冰上放置15 min。12 000 r/min，4 ℃离心10 min，小心弃去上清，缓慢沿离心管壁加入体积分数75%的乙醇1 mL洗涤1次，室温干燥沉淀，待乙醇快挥发完时，加入RNase-free水溶解沉淀，待沉淀完全溶解后于-80 ℃保存，并通过琼脂糖凝胶电泳来检测总RNA的完整性。

第2种方法：采用软骨RNAout柱式提取试剂盒提取软骨总RNA。先将冷冻的软骨组织液氮研磨成粉，加入1 mL溶液A(使用前必须放在65 ℃水浴使沉淀彻底溶解)溶解，然后将研磨物转移到新的1.5 mL离心管中，振荡混合30 s。

在装有研磨物/匀浆物的离心管中加入0.3 mL的溶液B，振荡器振荡30 s混匀(振荡器振荡时必须使管底溶液振荡起来)。加入0.2 mL氯仿，振荡器振荡30 s混匀。室温 12 000-15 000 ×g离心2-5 min。

将上清液(约0.8 mL)转移到另一干净的1.5 mL塑料离心管中，下层有机相和中间层含有DNA、蛋白质和其他杂质，避免触及或吸取。最好留下100 μL上清液不取。在上清液中加入0.5 mL的溶液C，振荡器振荡30 s混匀。加入0.2 mL的氯仿，振荡器振荡30 s混匀。室温12 000-15 000 ×g离心3 min，两相间将有白色膜状物(蛋白质)形成。

将上清液(约1 mL)转移到另一干净的1.5 mL塑料离心管中，避免触及或吸取有机相及其上面的白色膜状物。在上清液中加入0.5倍体积的溶液D，振荡器振荡30 s混匀，此时溶液呈白色浑浊状。室温12 000-15 000×g离心5-10 min，RNA将在管底形成白色沉淀(约黄豆大小)。

如果组织样品量少或需要提高RNA回收率，也可以延长离心时间到20-30 min。在离心管中加入1 mL体积分数75%的乙醇，振荡器上振荡混匀30 s。室温12 000-15 000 ×g离心5 min，RNA将在管底形成细小沉淀(约芝麻大小)。重复上步体积分数75%的乙醇洗涤1次，RNA将在管底形成细小沉淀。

小心吸弃上清液，注意不要吸弃RNA沉淀。再短暂快速离心，用移液枪小心吸弃残留液。加入适量(一般为20-50 μL) RNase-free水使RNA沉淀溶解，并通过琼脂糖凝胶电泳来检测总RNA的完整性。

第3种方法：采用RNeasy^® Lipid Tissue Mini Kit试剂盒提取软骨总RNA。

第4种方法：采用传统Trizol法提取大鼠肝细胞组织RNA，具体步骤同第一种方法。

RNA样品纯度、浓度及完整性检测：分别取各组样品总RNA 1 μL，用核酸蛋白分析仪测定RNA样品核酸的吸光度值A₂₆₀、蛋白质的吸光值A₂₈₀(以无RNase水为空白调零)，每样品重复3次，取其平均值，并计算A₂₆₀/A₂₈₀值；另取总RNA约10 μL，加入Loading buffer，65 ℃加热3 min，冰浴后，在1%琼脂糖凝胶上电泳，凝胶成像仪拍照，观察28 s、18 s条带及5 s条带是否存在及各条带亮度来检测样品RNA的完整性。

cDNA合成与转化生长因子β1 mRNA RT-PCR扩增：按照TaKaRa公司的PrimeScript^®RT reagent Kit With gDNA Eraser说明书进行，以合成的单链cDNA为模板，选择β-actin作为内参照，对转化生长因子β1 mRNA进行PCR扩增。

按以下条件进行PCR扩增：94 ℃预变性3 min，94 ℃预变性45 s，56 ℃复性60 s，72 ℃延伸1.5 min，扩增35个循环，72 ℃延伸1 min，4 ℃保存。

主要观察指标：测定各组总RNA A值，琼脂糖凝胶电泳检测各组总RNA的完整性，并通过RT-PCR检测转化生长因子β1 mRNA的表达。

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讨论

通过本次实验，作者觉得研究者在对软骨进行RNA提取时，应该注意以下几点：①软骨的取材和保存：在取材过程中，应对所有与软骨接触的物件进行去RNA酶处理，手术器械必须经高温消毒，180 ℃，4 h的高温消毒是可靠的，而且，对所取下的软骨应立即用液氮保存来运输或立即放入-80 ℃保存。②正确的匀浆方法：本实验表明，为了分离到高质量的RNA，软骨一定要在液氮中研磨成粉，在加入裂解液后，要细细匀浆，直至2 mL的注射器能够完全吸取匀浆液，匀浆的是否彻底也是保证RNA提取成功的关键步骤之一。③试剂的选择：本实验发现传统的Trizol法并不能有效的提取软骨中的RNA，这可能是由于软骨中本身细胞含量少，并且含有大量的糖类和胶原类物质，影响了RNA的释放，而基于无苯酚/氯仿柱式提取法的RNeasy^® Lipid Tissue Mini Kit提取的总RNA质量较高，能够满足后续试验需要。在对文献的研究中作者发现，国内外一些学者对动物各组织总RNA的提取已做过一些相关研究。张磊等^[7]使用QIAamp Viral RNA Mini Kit(Q法)，NucliSens miniMag系统(M法)和匹基(PG)丙型肝炎病毒定量试剂盒自带RNA提取方法(P法)进行血清HCV RNA提取研究，结果发现，从提取效率和收获RNA质量上看，M和Q法远远优于P法，进一步方法性能表明，M法为HCVRNA定量最佳提取方法，而P法因其提取效率低、收获RNA质量差以及重复性不好，不适合临床HCV RNA定量试验。郭俊良等^[8]利用改良的异硫氰酸胍法、改良的SDS法和改良的TRlpure试剂盒法对昆明小鼠心脏、肝脏以及肾脏进行组织总RNA的提取进行了研究，结果发现，试剂盒提取效果普遍明显优于其他方法，且适用于肝脏总RNA的提取，传统方法的改良适用于肾脏总RNA的提取，心脏总RNA的提取效果均不理想。进一步采用剪刀剪碎法、研钵加液氮研磨法、离心柱法对心肌组织总RNA的提取研究发现，研磨法提取出的总RNA量大，质量可靠，而剪碎法对于一些实验条件较差的地区仍然是一种可取的方法，其中过柱法对于少量心肌组织的提取较为适合^[9]。以上这些研究均表明，在提取各组织总RNA时，一定要考虑到每种组织的差异性，选择合适的方法才能提取到所需要的总RNA，以期为后续实验提供基础。在软骨组织总RNA提取方面，国内报道的文献多见于使用Trizol方法提取^[10-14]，只有几篇涉及到软骨组织提取方法的比较研究，其中刘玉刚等^[15]通过采用一步法、Trizol法、plantRNAout法和一步法结合plantRNAout法4种方法，对兔膝关节软骨组织总RNA的提取进行了相关比较研究，他们得出了与传统文献报道的提取软骨组织总RNA方法不同的观点：一步法、Trizol法、plantRNAout法获得的总RNA均含有蛋白多糖污染或DNA污染，不能满足实验需要，用一步法结合plantRNAout法提取的总RNA纯度高、完整性和稳定性好，能成功反转录合成双链cDNA。在国外报道中，有学者曾使用非Trizol法和试剂来提取软骨RNA^[15-18]，虽然均报道提取成功，但这些研究未能提供足够的证据来说明所提取RNA的完整性和质量，另外，Smale等^[19]运用三氟醋酸铯溶液梯度离心法先分离蛋白多糖与RNA，逐步沉淀RNA，也成功从软骨组织提取总RNA。Geyer等^[20]报道的采用无苯酚/氯仿的方法也成功的从软骨中提取到了质量高的总RNA。而Mallein-Gerin等^[21]在提取关节软骨总RNA时，把蛋白酶K加入到裂解液中，先使蛋白多糖分解，再除去蛋白酶，其获取的总RNA完成了后续的RT-PCR。McKenna等^[22]在实验中发现，应用植物RNA提取试剂能够防止蛋白多糖污染，然后再用DNA酶消除DNA污染，其所获得的总RNA能够满足后续实验需要。上述这些方法在裂解软骨时均加入其他试剂，且步骤繁琐，提取时间较长，无疑都增加了总RNA被RNA酶污染的机会，也增加了RNA降解的机会。因此，如何寻求一种快速、简便的关节软骨总RNA提取方法至关重要。

所以，从目前研究结果来看，作者认为，以往国内文献报道的采用传统Trizol法来提取大鼠软骨RNA的方法欠妥，其法所提取的RNA的纯度和完整性满足不了后续实验的要求，这可能由于软骨组织中只含有少量的细胞和大量的细胞外基质分子所造成，而且大鼠本身膝关节软骨组织量比较少，其组织特殊性要求在提取RNA时一定要采用合适的方法，方能得到满意的结果，虽然刘玉刚等报道的一步法结合plantRNAout法提取的总RNA效果好，但是，其操作相对复杂，而本次实验采用RNeasy^® Lipid Tissue Mini Kit法提取的软骨RNA，不仅操作简单，整个操作过程只需15 min左右，而且其纯度和完整性较好，为后续实验的成功奠定了基础。

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